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原位雜交（fish）實驗技術
原位雜交是 一種在完整染色體內對特異性DNA片段定位的技術。即以探針(如DNA、RNA探針等)直接探測靶分子或靶序列在生物體(染色體、細胞、組織、整個生物體等)內的分布狀況。
原位雜交組織(或細胞)化學 (In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 簡稱原位雜交(In Situ Hybridization)，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據探針的標記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交，雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術或成色酶促反應直接顯示。間接法一般用半抗原標記探針，最后通過免疫組織化學法對半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。原位雜交最初是以同位素標記探針進行的。盡管同位素標記(如35S，3H，32P等)仍然廣泛使用，但非同位素標記探針的迅速發展(尤其是生物素標記探針和地高辛標記探針)，更引起科技工作者的極大興趣。
一、基本要求
組織取材：組織取材應盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養細胞最好在30min內固定。
固定目的是：
(1)保持細胞結構；
(2)最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；
(3)使探針易于進入細胞或組織。
最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑(如戊二醛)不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。
增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：
(1)稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合，以降低背景，雜交前標本可用0.25%乙酸酐處理10min，經乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團通過乙?；蛔钄?。組織和細胞標本亦可用0.2M HCl處理10min，稀酸能使堿性蛋白變性，結合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。
(2)去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進入組織細胞，最常應用的去污劑是Triton X-100。注意：過度的去污劑處理不僅影響組織的形態結構，而且還會引起靶核酸的丟失。
(3) 蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K)，還有鏈霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)等。
雜交緩沖液孵育：
雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2hr，以阻斷玻片和標本中可能與探針產生非特異性結合的位點，達到減低背景的目的。
防止污染：
由于在手指皮膚及實驗室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實驗所用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤(180℃)以達到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時所用的溶液均需經高壓消毒處理。
雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：
雜交反應進行時，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進行雜交(包括檢測RNA時)，雙鏈DNA探針在雜交前必須進行變性。探針變性后要立即進行雜交反應，不然解鏈的探針又會重新復性。
雜交液：
雜交液內除含一定濃度的標記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。
雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標本之間的靜電結合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA:RNA，RNA:DNA，DNA:DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。所以，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態結構的破壞以及標本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達到提高雜交率的目的(尤其對雙鏈核酸探針)。在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結構成分之間的非特異性結合，以減低背景。
探針的濃度：
探針濃度依其種類和實驗要求略有不同，一般為0.5-5.0μg/ml(0.5-5.0ng/μl)。最適宜的探針濃度要通過實驗才能確定。
探針的長度：
一般應在50-300個堿基之間，最長不宜超過400個堿基。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。
二、試劑準備
1． 0.1M PBS (pH7.2)：Na2HPO4•12 H2O 61.6g、NaH2PO4•2 H2O 5.6g、NaCl 9g，加ddH2O至2000ml，高壓滅菌。
2． 0.2M PB ((pH7.2)：Na2HPO4•12 H2O 61.6g、NaH2PO4•2 H2O 5.6g 加ddH2O至1000ml，高壓滅菌。
3． 0.1M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1M PBS，定容至100ml，高壓滅菌。
4． 4%多聚甲醛：多聚甲醛40g加ddH2O 400ml，加熱至70℃左右，用1M NaOH調pH至7.0，用ddH2O定容至500ml，再加0.2M PB
500ml，總體積為1000ml。
500ml，總體積為1000ml。
5． 16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4g、小牛血清白蛋白（BSA） 0.4g、聚蔗糖0.4g，加dd H2O至10ml，無菌抽濾、分裝， -20℃保存備用。
6．預雜交液：去離子甲酰胺10ml、50%硫酸葡聚糖4ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2ml、1M Tris-HCl(pH 8.0) 0.2ml、5M NaCl 1.2ml、0.5M EDTA(pH 8.0) 0.04ml、0.1M二硫蘇糖醇 2 ml、ddH2O 2.21ml，總體積為10ml。無菌抽濾、分裝，-20℃保存備用。臨用前加入50mg/ml變性鮭魚精DNA 75μl/ml。
7． 20×SSC: NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加水至800ml，用2N NaOH調pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。
8．抗體稀釋液：Triton X-100 80μl、BSA 0.2g，以0.05M PBS定容至20ml。
9． TSM1：1M Tris-HCl(pH 8.0)10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml，加ddH2O 100ml。TSM2（新鮮配制）：1M Tris-HCl(pH 9.5)10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml，加ddH2O至100ml。
顯色液（臨用前現配）：5ml TSM2 加顯色液原液（NBT/BCIP）150μl，并加適量左旋咪唑使其終濃度為0.24μg/ml，避光。
三、操作步驟
（一）取材、冰凍切片：
將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交專用玻片上，切片厚度為15-20μm。
（二）探針制備與檢測（定量）：
1．隨機引物制備cDNA核酸探針以DIG DNA 標記檢測試劑盒為例：
（1）探針制備：
①模板DNA(0.5-3μg) 15μl，100℃變性10min，冰浴5 min。
②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2μl， dNTPmix 2μl，Klenow Enzyme 1μl，反應總體積為20μl。37℃孵育過夜。
③在上述20μl的標記產物中加4M LiCl 2.5μl，75μl（無水乙醇預冷，輕輕混勻，-20℃放置 2hr。4℃離心12000g×15min，棄上清。70%乙醇(預冷) 50μl洗滌，7500g×5min，棄上清，晾干沉淀，加TE 50μl溶解沉淀，-20℃保存備用。
（2）探針敏感性檢測：
①樣品稀釋：取dig-標記探針1μl 用ddH2O以1:10、1:100、1:1000、1:1000、1:10000梯度稀釋。
②取一張與點樣器大小相近的尼龍膜，標記方向，ddH2O中浸泡 1min，6×SSC中浸泡10min，置點樣器上，負壓抽吸5min。
③將上述樣品點于尼龍膜上，繼續抽吸10min。
④取下尼龍膜，置紫外燈下10cm處照射5min，晾干。
⑤將膜置于適量預雜交液（5-10 ml）中，37℃預雜交10min。
⑥加入Anti-dig 抗體（1:5000），37℃雜交30min。
⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室溫洗10 min×2次。
⑧顯色：15 mlTSM2中加300μl顯色液（NBT/BCIP），37℃避光顯色30min。
1． PCR法制備cDNA核酸探針：
（１）探針制備：
以PCR DIG Probe Synthesis Kit 為例：
在0.5ml離心管中，依次加入：
PCR引物 1（10pM） 2μl；
PCR引物 1（10pM） 2μl；
質粒DNA 模板（10-100pg） 2μl；
PCR DIG mix 2μl (含dNTP和DIG-11-dUTP)；
dNTPmix 2μl；
10×PCR buffer 5μl；
Taq 酶（2u/μl） 1μl；
加入適量ddH2O，使總體積達50μl。
①將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。
一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 45s → 58℃ 45s → 72℃ 60s，循環30-35次，最后在72℃保溫7min。
②在上述PCR產物中加入4M LiCl 12.5μl、預冷無水乙醇375μl，輕輕混合后置于-20℃2hr, 12,000g×15min，棄上清。70%乙醇(預冷) 120μl洗滌沉淀，離心7500g×5min，棄上清，晾干沉淀,加TE 50μl溶解,-20℃保存備用。
（2）探針檢測：
行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量（采用目測法）。
（三）原位雜交反應（以DIG-cDNA探針為例）：
1．0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
2．0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
3．0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
4．0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。
5． 4%多聚甲醛浸5min。
6． 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
7．預雜交：滴加適量預雜交液，42℃ 30 min。
<1>．雜交：傾去預雜交液，在每張切片上滴加10-20μl雜交液（將探針變性后稀釋在預雜交液中，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟膜，42℃過夜。
<2>．洗片：
(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；
0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC與0.1M PBS各半洗10min；
0.05M PBS 洗 5min×2次。
10．3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min。
11．滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復合物（以抗體稀釋液1:5000稀釋）4℃孵育過夜。
12．0.05M PBS洗15min×4次；TSM1 10min×2次；新鮮配制TSM2 10min×2次。
13．顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過夜。
14．將玻片置于TE中10-30min以終止反應。酒精梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹膠封片。
15．顯微鏡下觀察結果。
四、注意事項：
1.作為DNA-RNA的雜交，需防RNase的污染。
2.cDNA探針在雜交時必須變性解鏈。具體方法是：將探針置100℃加熱5min，冰浴驟冷。
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